Microbiología: Procedimiento de aislamiento de bacterias mediante el método siembra en placa por Estrías

Aislamiento de Bacterias

La piel (en condiciones normales) es una barrera que impide la penetración de los gérmenes, por ello actúa como mecanismo de defensa. Los mamíferos son frecuentemente infectados por algunas de las bacterias preexistentes en su medio ambiente, aunque en general viven en equilibrio con estos microorganismos, manteniéndoles limitados a zonas relativamente superficiales de su organismo. Sin embargo las bacterias infecciosas producen enfermedades al invadir tejidos más profundos. Por lo tanto para mantener la salud, el huésped debe defenderse constantemente frente a la invasión por parte de las bacterias.

Los factores mecánicos, químicos y microbianos desempeñan un papel importante al restringir la colonización de las bacterias a las superficies corporales.

Factores mecánicos: Las superficies epiteliales de la piel y de las mucosas constituyen barreras que resultan más o menos impermeables a las bacterias. La impermeabilidad de la piel es mayor que en la mayoría de las mucosas. Cuando se altera la integridad de la superficie epitelial, pueden desarrollarse infecciones subcutáneas. Las bacterias que causan más frecuentemente estas infecciones son las que existen habitualmente en la superficie cutánea, folículos pilosos y glándulas sudoríparas en la piel, es decir los estafilococos.

Factores químicos: La acidez de las secreciones gástricas mantienen sin duda la esterilidad habitual del estómago. El Ph bajo de la piel (3-5), debido en gran parte a los productos ácidos del metabolismo bacteriano, frena sin duda el crecimiento de muchos microorganismos que toman contacto con sus superficie.

Factores microbianos: El antagonismo microbiano inhibe el crecimiento de muchas bacterias y hongos potencial mente patógenos en lugares superficiales donde de no ser así, podrían producirse enfermedades.

La flora de la región faríngea presenta problemas peculiares para el aislamiento e identificación de microorganismos, por lo tanto se refiere a los componentes de la flora normal como a microorganismos con acción patógena. Es importante recordar que algunos microorganismos tienen capacidad patógena definida y su presencia es un indicio claro de enfermedades, en tanto que otros, llamados oportunistas, guardan una posición ambigua y pueden encontrarse tanto como componentes de la flora normal, como asociados a procesos patológicos, causados por otros microorganismos que son verdaderos responsables (por ejemplo los virus) Los estafilococos están entre las primeras bacterias que se reconocieron como patógenas, y se descubrieron por primera vez a principios de la década de1880.

Se encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza, y a menudo forman parte de la flora bacteriana de la piel y el tracto respiratorio superior; muchas de las especies que se encuentran en el hombre son comensales. La especie predominante patógena para el hombre es el staphylococcus aureus, constituye la causa más común de las infecciones supurativas para el hombre. El aislamiento de S. aureus a partir del exudado faríngeo y exudado de piel, no tiene importancia diagnóstica, ya que se considera parte de la flora normal de la faringe y nasofaringe, por lo que no tiene significado clínico.

PROCEDIMIENTO:
A) Raspado de piel

1.- Limpiar y esterilizar el área a trabajar con fenol al 5%

2.- Prender el mechero fischer cerca de donde se va a trabajar, si es posible colocar otro

3.- Humedecer el hisopo en solución salina estéril, pasarlo sobre la superficie de la piel (con o sin pelo)

4.- Descargar el hisopo en dos cajas de petri con el medio ya preparado. (Es recomendable que para cada dos cajas se utilice un solo hisopo con muestra). No retires completamente las tapas de los medios de cultivo para evitar que se contaminen

5.- quemar el hisopo y tirarlo.

6.- Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo vivo, enfríalo introduciéndolo en un extremo del Agar

7.- Realiza el sembrado de los microorganismos por el método de estría utilizando el asa y como se muestra en la figura. Evita destapar completamente la tapa de los medios de cultivo.

8- Repetir el mismo proceso con otro hisopo estéril y con solución salina para otras dos cajas . siembra por estría utilizando el Asa de platino y así hasta que se terminen se sembrar todos los medios preparados.

9.- Incubar a 37ºC por 24-48 horas y observar resultados.10.- Repite el mismo procedimiento pero ahora toma muestra de la faringe con hisopos estériles en las zonas afectadas como: amígdalas, pared posterior de la faringe, en general cualquier área que manifiesta signos de inflamación, exudados y úlceras, procurando no tocar con el hisopo la lengua.

B) CULTIVO DE BACTERIAS A PARTIR DE UN FROSTIS FARÍNGEO

OBJETIVOS

Comprender el concepto de colonia bacteriana, medio de cultivo y halo de inhibición
Conocer las técnicas de siembra y cultivo de bacterias
Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulación de materiales biológicos.
Comprender la importancia de la eliminación de los residuos orgánicos
Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiología y los procedimientos para su utilización

MATERIALES

Depresor de lengua
Torunda o hisopo estéril
Placas de agar-sangre
Asa de siembra
Rotulador de vidrio
Cinta adhesiva
Contenedor de residuos orgánicos

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Antes de empezar

No se puede tocar nada que vaya a tomar contacto con la muestra biológica con las manos (depresor, asa de siembre, torunda,...) para evitar contaminaciones.
Una vez utilizado este material ha de ser eliminado en un contenedor especial. Estos contenedores serán llevados posteriormente a una planta de tratamiento de residuos biológicos, donde serán incinerados.
Todos los materiales o muestras tomadas deben estar perfectamente identificados: nombre, grupo, fecha e indicativo del tipo de muestra.
Las placas sembradas deben sellarse con cinta adhesiva al finalizar para evitar su contaminación o la nuestra.
Al acabar la práctica, se deben lavar bien las manos.

Toma de la muestra

Se abre con cuidado, por un extremo, el depresor de madera, sin tocar el otro extremo para mantenerlo estéril.
Distribuidos por parejas, uno de los miembros de la pareja sujeta con el depresor la lengua del otro, colocándola pegada al suelo de la boca, manteniendo despejada la abertura bucal.
CON CUIDADO, se introduce una torunda y se tocan suavemente las amígdalas, en donde se encuentran bacterias, intentando evitar el contacto con la lengua u otras zonas. Es normal que se provoque un reflejo de arcada. En este caso, se separa la torunda y se vuelve a intentar.
Al finalizar, se tira el depresor al contenedor de desechos orgánicos.
Se tapa la torunda y se rotula con el nombre del donante y la fecha, indicando con una F, que se trata de un frotis faríngeo.

Siembra A continuación se toma una placa de agar-sangre y se procede a la siembra del material recogido con la torunda o Hisopo. Se extrae la funda de la torunda y se pasa SUAVEMENTE por la superficie, cubriendo el área señalada en el dibujo como (A) Al finalizar, se tira el hisopo al contenedor de desechos orgánicos.

Aislamiento

Para intentar que las colonias crezcan separadas tomamos un asa de siembra y se realizan resiembras en dos zonas:

(B) Tocando con el asa la zona (A) se realiza una línea zig-zagueante SUAVEMENTE sobre la superficie (no hay que perforar la superficie del agar-sangre) (C) Sin tocar las anteriores zonas. Se tapa y se sella la placa con cinta adhesiva.
Se rotula la tapa indicando el nombre del donante, su grupo-clase, la fecha y la F (de frotis faríngeo).

Incubación y observación

Se llevan las placas a incubar a 37ºC (temperatura corporal), durante 24 horas. Tras este período se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento bacteriano.

Al finalizar la práctica se entregan las placas al profesor para que sean destruidas junto con el resto de material empleado.

OBSERVACIÓN

El medio de cultivo agar-sangre es un medio nutritivo general, no selectivo, en el cual pueden crecer casi todos los tipos de microorganismos. Su nombre deriva de que contiene un 5-10% de sangre desfibrinada (no coagula) extraída de caballo, conejo o, sobre todo, de carnero.

Las bacterias existentes en la faringe pueden ser de dos tipos:

Flora bacteriana propia o normal, de vida saprofita (crecen sobre restos de comida).
Flora patógena, que provoca enfermedades (especialmente Streptococcus pyogenes, responsable de la faringitis aguda, la fiebre reumática, angina estreptocócica, escarlatina, erisipela)

Al tomar una muestra de la faringe, las bacterias existentes empiezan a dividirse. De una bacteria se forman miles o millones, dando lugar a una colonia, visible a simple vista. Todas las bacterias de una colonia son genéticamente idénticas a la bacteria que las originó e iguales entre sí.

Las resiembras tienen por objetos intentar conseguir que se formen colonias aisladas de la masa principal.

Al contener el medio de cultivo glóbulos rojos (agar-sangre) si existiera algún microorganismo patógeno se produciría la destrucción de estos glóbulos rojos, ya que estas bacterias tienen enzimas que rompen las paredes de los glóbulos rojos, y se formaría un halo de hemólisis: alrededor de la colonia de bacterias patógenas se forma una zona transparente. Así se detecta su presencia en la faringe.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

A) REACCIONES POSITIVAS EN DISTINTOS MEDIOS

GELOSA SANGRE

Para el aislamiento, cultivo y detección de actividad hemolítica de Staphylococcus, Streptococcus y otros microorganismos fastidiosos. Se observan colonias blancas casi grises, Grandes, convexas de consistencia butirácea, Presentan bordes regulares. Se observa que Presenta hemólisis. Las colonias en medio sólido son redondeadas, uniformes, Estos crecen rápidamente a 37° C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20 ° C).

MANITOL SAL AGAR (MSA)

Se utiliza como medio selectivo, para cultivar y enumerar especies clínicas de estafilococos El manitol cuando es utilizado por los microorganismos, vira de su color original rojo a amarillo. Se observan colonias chicas, blancas, convexas, de consistencia butirácea , presentan bordes irregulares. S. aureus Manitol sal Colonia amarilla S. epidermidis Manitol sal Colonia incolora

AGAR VOGEL Y JONSON (AVJ)

Para la detección de Staphylococcus aureus coagulasa-positivo, se observan colonias negras Pequeñas. bordes irregulares con halo amarillo. Para S. epidermidis y otros Pequeñas, negro-grisáceos, sin halo, El medio presenta un vire de rojo pálido a amarillo.

ESTAFILOCOCO S110

S110 Colonias blancas un poco amarillentas, Se observan colonias chicas, convexas, De consistencia butirácea y bordes Regulares.

B) DESCRIPCIÓN DEL TIPO DE COLONIAS OBTENIDAS
Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes características: